大鼠低氧誘導(dǎo)因子1αelisa試劑盒采用ELISA技術(shù),通過雙抗體夾心法或競爭法,利用純化的抗體包被微孔板,與待測樣品中的HIF-1α特異性結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,再經(jīng)過洗滌、顯色和終止反應(yīng)等步驟,通過酶標(biāo)儀測定吸光度來計算樣品中HIF-1α的濃度。

一、實驗前準(zhǔn)備
1、試劑盒檢查:確認(rèn)試劑盒包含標(biāo)準(zhǔn)品、檢測抗體、酶結(jié)合物、底物、終止液、洗滌液等,并檢查是否在有效期內(nèi)。
2、樣本準(zhǔn)備:采集大鼠組織或細(xì)胞樣本,按要求處理(如勻漿、離心)并保存于-80°C。
3、試劑平衡:將試劑盒從冰箱取出,室溫平衡30分鐘。
4、儀器準(zhǔn)備:確保酶標(biāo)儀、移液器、離心機(jī)等設(shè)備正常工作。
二、實驗步驟
1、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋:按說明書將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋,通常設(shè)置6-8個濃度點。
2、加樣:將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本加入酶標(biāo)板孔中,每孔100μL,設(shè)置空白對照。
3、孵育:37°C孵育1-2小時,使HIF-1α與包被抗體結(jié)合。
4、洗滌:棄去孔內(nèi)液體,加入洗滌液,靜置30秒后棄去,重復(fù)3-5次。
5、加檢測抗體:每孔加入100μL生物素標(biāo)記的檢測抗體,37°C孵育1小時。
6、洗滌:重復(fù)洗滌步驟。
7、加酶結(jié)合物:每孔加入100μL酶結(jié)合物,37°C孵育30分鐘。
8、洗滌:再次洗滌。
9、加底物:每孔加入100μL底物溶液,避光孵育15-30分鐘。
10、終止反應(yīng):每孔加入50μL終止液,顏色由藍(lán)變黃。
11、讀數(shù):用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度。
三、數(shù)據(jù)分析
1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、計算樣本濃度:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中HIF-1α的濃度。
四、注意事項
1、操作規(guī)范:避免污染,使用一次性吸頭。
2、時間控制:嚴(yán)格控制孵育和洗滌時間。
3、儀器校準(zhǔn):確保酶標(biāo)儀和移液器準(zhǔn)確。
4、重復(fù)實驗:每個樣本至少做3次重復(fù),確保結(jié)果可靠。